使用基于镧系元素掺杂纳米颗粒的侧流免疫测定法快速灵敏地检测抗 SARS-CoV-2 IgG
2023-03-08 22:54:25 点击：
试剂、样品和仪器
三（1，3-二苯基-1，3-丙二酸）（1，10-菲咯啉）铕（III）3苯乙烷）、苯乙烯（St）、丙烯酸（AA）、2，2′-偶氮二（异丁腈）（AIBN）和十六烷基三甲基铵（CTMA）是从东京化学工业株式会社（日本东京）购买的。2-（N-吗啉基）乙磺酸（MES），表面活性剂（包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和TritonX-100），羧基活化剂（包括1-乙基-3-（3-（二甲基氨基）丙基）碳酰亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺（磺基-NHS））和Proclin-300是从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得的。功能性嵌段聚合物Tetronic 1307（表面活性剂S9）从巴斯夫公司（美国新泽西州弗洛勒姆公园）获得。兔IgG和山羊抗兔IgG是从Rockland Immunochemicals（美国宾夕法尼亚州利默里克）购买的。小鼠抗人 IgG 来自 Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）。硝酸纤维素（NC）膜、玻璃纤维共轭垫和纤维素吸收垫购自密理博（中国香港）。纤维素样品垫来自捷益生物科技有限公司（中国上海）。牛血清白蛋白（BSA）从罗氏诊断公司（中国香港）获得。本研究中使用的其他化学品为分析级，未经进一步处理即可使用。使用Milli-Q Advantage A10纯化系统（Millipore）获得的超纯水用于所有实验。
使用以下缓冲溶液：包被缓冲液（0.3%海藻糖[w/v]和0.1%NaN3[w/v] 在 100 mM 柠檬酸盐缓冲盐水 [CBS] 中，pH 8.5）;样品垫处理缓冲液（100 mM Na2B4O7·10+2O、1% PVP [w/v]、0.2% 酪蛋白-Na [w/v]、1% TritonX-100 [v/v]和 0.1% NaN3[w/v]）;共轭垫处理缓冲液（0.5% 聚乙烯醇 [PVA] [w/v]、0.5% BSA [w/v] 和 1% TritonX-100 [v/v] 在 50 mM 磷酸盐缓冲液中，pH 7.4）;活化缓冲液（50 mM MES，pH 5.1）;结合缓冲液（10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0）;洗涤缓冲液（0.2% 吐温-20 [v/v]、0.9% 氯化钠 [w/v] 和 0.05% Proclin-300 [v/v] 在 25 mM Tris-HCl 中，pH 7.8）;储存缓冲液（1% BSA [w/v]、5% 海藻糖 [w/v]、20% 蔗糖 [w/v] 和 0.05% Proclin-300 [v/v] 在 25 mM Tris-HCl 中，pH 9.0）;和测定缓冲液（7.5% BSA [w/v]、0.3% TritonX-100 [v/v] 和 0.1% 表面活性剂 S9 [w/v] 在 10 mM PBS，pH 7.4 中）。本研究中的所有溶液在使用前均新鲜制备。
从广州市第八人民医院和南方医院获取血清样本，并在-20°C下保存直至使用。本研究已获得南方医科大学科技系伦理委员会（中国广州）的批准。
重组SARS-CoV-2核衣壳磷酸蛋白的表达
SARS-CoV-2的RNA基因组由DAAN Gene Co.（中国广州）提供。使用PrimeScript II第一个链cDNA合成试剂盒（Takara Bio，日本大津;货号 6210A）。使用以下引物通过PCR从cDNA扩增全长核衣壳磷蛋白基因：5′-ATG TCT GAT AAT GGA CCC CAA AAT C-3′（正向）和5′-TTA GGC CTG AGT TGA GTC AGC −3′（反向），这些引物是基于GenBank（MN908947.3）中的序列设计的。对PCR产物进行测序并克隆到pMD-19T骨架载体中;将所得pMD-19T-N质粒与线性pET-32a载体（非I）融合，使用无缝克隆和组装试剂盒（北京佐曼生物科技有限公司，中国北京;目录号ZC231），其中核衣壳磷蛋白基因使用引物5′-AG CTC CGT CGA CAA GCT TGC ATG TCT GAT AAT GGA CCC CAA AAT-3′（正向）和5′-TG GTG GTG GTG CTC GAG GGC GGC GG AGT TGA GTC AGC ACT-3′（反向）扩增。通过异丙基β-d-21-吡喃硫代半乳糖苷诱导，在大肠杆菌BL1感受态细胞中表达靶蛋白，并优化诱导时间以确保最大表达。使用阳性血清样品通过蛋白质印迹确认纯化重组蛋白的抗原性。
LNP的制备
LNPs采用最小乳液聚合法合成。简而言之，200毫克Eu（DPP）3将Phen和20mgAIBN溶解在玻璃小瓶中的2gSt中;将60 mgCTMA和100 mgAA溶于15 mL去离子水中。将水溶液和单体溶液与磁力搅拌器混合10分钟，并在冰浴中用超声仪制备微型乳液20分钟。将氮气在室温下鼓泡2h以除去混合物中的氧气，然后将乳液在室温下搅拌20h。将产物用水超声洗涤4次并离心。将所得LNP分散在水中（5%w / v）中，并在4°C下作为库存储存。
用蛋白质分子功能化LNP
如前所述，LNP用小鼠抗人IgG抗体（M-HIgG）和兔IgG（RIgG）功能化，(20)进行了一些修改。使用两步程序来防止LNP之间通过抗体分子的交联聚集。简而言之，将 20 μL EDC（1% EDC [w/v] 在活化缓冲液中）和 180 μL 磺基-NHS（1% 磺基-NHS [w/v] 在活化缓冲液中）溶液混合，并加入重悬于 2.0 mL 活化缓冲液中的 8 mg LNP 中。将混合物在室温下轻轻搅拌孵育30分钟。为了去除未反应的组分，在形成NHS-酯后，通过以18000g离心10分钟洗涤LNP三次。将沉淀超声重悬于0.95 mL结合缓冲液中。纯化抗体并在结合缓冲液中以1 mg/mL的浓度稀释;将 50 μL 制备的抗体溶液（M-HIgG 或 RIgG）加入活化的 LNP 悬浮液中。应用轻轻旋转孵育4小时，然后加入1.5μL乙醇胺，并将混合物进一步孵育10分钟。为了纯化功能化的LNP，在加入封闭缓冲液（2mM磷酸盐缓冲液中的25%BSA，pH 7.4）之前重复洗涤过程三次。将功能化的LNPs超声重悬于封闭缓冲液中，并采用温和混合的30分钟孵育以阻断LNP表面上任何剩余的未反应疏水位点并形成薄的水合层以防止聚集。用洗涤缓冲液清洁抗体搪瓷LNP三次，然后重悬于储存缓冲液中。
LFIA带材的制造
LFIA条带的制备方式如我们之前的工作中所述。(21)将样品垫浸入样品垫处理缓冲液中1小时，并在37°C下干燥24小时。将共轭垫在室温下用共轭垫处理缓冲液饱和1.5小时，并在37°C下干燥24小时。将M-HIgG@LNPs和RIgG@LNPs在储存缓冲液中稀释（分别为0.125和0.05 mg/mL）并合并;使用Biolet Queti分配器（BioDot，上海，中国）将混合物以1μL/cm分液到共轭垫上，并在37°C下干燥，然后在室温下储存在干燥柜中直至使用。用浓度为2 mg/mL的包衣缓冲液稀释重组核衣壳磷蛋白和山羊抗兔IgG，然后分配到NC膜上（Millipore;货号 HF13502XSS） 分别为 1 和 0.8 μL/cm，作为测试线和对照线。将膜在37°C下干燥4小时。将NC膜，吸收垫，共轭垫和样品垫依次层压到背卡上，如图1所示。 切割4毫米宽的条带并放入一次性塑料外壳中以供以后使用。组装好的试纸存放在防潮柜中。
图1
图1.开发和制造开发的测定方法。（一）侧流试纸。（B） 测定。
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